Убиквитин-протеасомная система: как клетка разбирает белки

Убиквитин-протеасомная система (UPS) - главный путь избирательной деградации внутриклеточных белков у эукариот: маленький белок убиквитин из 76 аминокислот метит субстрат цепочкой своих же копий, и эта метка направляет его в 26S протеасому, где белок разбирается на короткие пептиды. Без UPS клетка не может вовремя убрать циклины после митоза, погасить сигнал транскрипционного фактора NF-κB или уничтожить неправильно свёрнутый белок, поэтому сбои в этой системе связывают с раком, нейродегенерацией и иммунными нарушениями. Ниже разберём каскад ферментов E1, E2 и E3, порог полиубиквитинирования, строение 26S протеасомы и то, как кинетику деградации можно посчитать количественно. Чтобы сразу увидеть связь длины убиквитиновой цепи, активности E3-лигазы и скорости распада белка, покрути калькулятор ниже, а дальше разберём каждую формулу подробно.

Три фермента одного каскада: E1, E2 и E3

Присоединение убиквитина к субстрату всегда идёт через последовательность из трёх классов ферментов, и каждый следующий шаг сужает выбор мишени:

Рассчитать для своей задачи

1. E1, убиквитин-активирующий фермент. Расходуя АТФ, E1 образует с С-концевым глицином убиквитина высокоэнергетическую тиоэфирную связь. В клетке обычно всего 1-2 гена E1 - это горлышко, через которое проходит весь поток убиквитина.
2. E2, убиквитин-конъюгирующий фермент. Принимает активированный убиквитин от E1 и удерживает его до встречи с E3. Известно несколько десятков E2-ферментов, и от того, какой E2 работает с конкретной E3-лигазой, зависит тип образующейся цепи.
3. E3, убиквитин-лигаза. Именно E3 определяет специфичность: она узнаёт конкретный субстрат (часто по фосфорилированному или иначе модифицированному мотиву-degron) и катализирует перенос убиквитина с E2 на лизин субстрата или растущей цепи. E3-лигаз в геноме человека сотни, и именно их разнообразие обеспечивает избирательность всей системы.

После первого переноса реакция повторяется: новая молекула убиквитина присоединяется уже к предыдущей, и на субстрате вырастает полиубиквитиновая цепь.

Полиубиквитиновая цепь и порог узнавания

Убиквитин содержит семь лизинов, и цепь может расти через любой из них, но для деградации в протеасоме важна цепь, сшитая через лизин-48 (K48). Классический эксперимент показал: протеасома эффективно узнаёт субстрат только начиная с цепи из четырёх и более убиквитиновых звеньев, то есть тетраубиквитина. Более короткие моно- и диубиквитиновые метки чаще служат другим сигналам - эндоцитозу, изменению локализации белка, репарации ДНК, а не разрушению.

Рассчитать для своей задачи

Такое пороговое поведение удобно описать сигмоидой:

$$P(n) = \frac{1}{1 + e^{-1{,}6\,(n - 4)}},$$

где $n$ - число молекул убиквитина в K48-цепи, а $P(n)$ - доля молекул субстрата, которые протеасома успевает узнать и начать разбирать. При $n = 4$ вероятность узнавания составляет ровно половину от максимальной, при $n \le 2$ она падает ниже 4%, а при $n \ge 7$ приближается к 100%. Именно поэтому клетке невыгодно тратить ресурсы на моноубиквитинирование, если цель - разрушение белка: короткая цепь просто не задержит его в протеасоме достаточно долго.

Строение 26S протеасомы: 20S сердцевина и 19S регуляторные частицы

26S протеасома - крупный белковый комплекс, состоящий из двух функционально разных частей:

• 20S каталитическая частица - полая бочка из четырёх колец по семь субъединиц (два внешних α-кольца и два внутренних β-кольца). Внутри неё расположены три типа протеолитической активности: химотрипсин-подобная, трипсин-подобная и каспаза-подобная, каждая режет пептидную связь по своим предпочтениям к боковым цепям аминокислот.
• 19S регуляторная частица - «крышка», которая садится на одно или оба основания 20S бочки. Она узнаёт полиубиквитиновую цепь, снимает с неё убиквитин (чтобы вернуть его в клеточный пул), с затратой АТФ разворачивает белок в линейную цепь и проталкивает через узкий канал внутрь 20S частицы.

Без 19S регуляторной частицы 20S бочка почти не работает с полноразмерными свёрнутыми белками: канал в α-кольце слишком узок, чтобы пропустить неразвёрнутую структуру. Это разделение труда объясняет, почему в клетке 26S протеасома собирается и разбирается динамически, подстраиваясь под нагрузку по деградации.

Кинетика деградации: как считать период полураспада белка

Как только цепь достигла порога узнавания, дальнейшая деградация помеченного белка хорошо описывается кинетикой первого порядка. Константу скорости деградации удобно представить как произведение трёх множителей: вероятности узнавания протеасомой, относительной активности E3-лигазы и доли доступного АТФ:

$$k_{deg}(n, E_3, \mathrm{ATP}) = k_{max}\, P(n)\, E_3 \left(\frac{\mathrm{ATP}}{100}\right),$$

где $k_{max} = 0{,}7$ мин⁻¹ - предельная константа скорости при полностью насыщенной цепи, базовой активности E3-лигазы ($E_3 = 1$) и полном запасе АТФ. Убыль концентрации помеченного белка во времени тогда подчиняется обычной экспоненте:

$$\frac{C(t)}{C_0} = e^{-k_{deg}\,t}, \qquad t_{1/2} = \frac{\ln 2}{k_{deg}}.$$

При дефолтных значениях калькулятора ($n = 4$, $E_3 = 1$, ATP = 100%) константа скорости получается $k_{deg} \approx 0{,}35$ мин⁻¹, а период полураспада - около двух минут, что близко к реальным цифрам для короткоживущих регуляторных белков вроде циклинов и субъединиц IκB. Если цепь короче порога или АТФ в клетке мало, $k_{deg}$ падает почти до нуля, и белок фактически стабилизируется, даже оставаясь помеченным убиквитином.

АТФ и деубиквитинирующие ферменты: экономика убиквитина

Убиквитин-протеасомная система тратит АТФ на двух разных этапах, и это не случайность, а способ придать процессу направленность и контроль:

Рассчитать для своей задачи

1. На стадии E1 АТФ расходуется, чтобы активировать сам убиквитин, - без этого переноса на E2 просто не произойдёт.
2. На стадии 19S регуляторной частицы АТФ расходуется на разворачивание субстрата и его протаскивание через канал в 20S бочку.

Перед тем как белок попадёт внутрь 20S частицы, деубиквитинирующие ферменты (DUB), встроенные в 19S частицу, снимают с него полиубиквитиновую цепь целиком, а затем режут её на отдельные молекулы убиквитина. Так убиквитин не расходуется безвозвратно, а возвращается в клеточный пул для новых циклов мечения - этот рециклинг экономит ресурсы клетки и одновременно служит точкой дополнительного контроля: некоторые DUB могут «спасти» субстрат, разобрав цепь раньше, чем он дойдёт до протеолиза.

Зачем клетке эта система: p53, NF-κB и контроль клеточного цикла

Убиквитин-протеасомная деградация регулирует практически все ключевые переключатели клетки. Опухолевый супрессор p53 в норме постоянно метится E3-лигазой MDM2 и быстро распадается; при повреждении ДНК это мечение подавляется, p53 стабилизируется и запускает остановку цикла или апоптоз. Транскрипционный фактор NF-κB удерживается в цитоплазме ингибитором IκB; сигнал воспаления запускает фосфорилирование и убиквитинирование IκB, его быструю деградацию и высвобождение NF-κB в ядро. Переход клетки из митоза в интерфазу требует, чтобы комплекс APC/C пометил циклин B и другие регуляторы для немедленного разрушения - без этого клетка не выйдет из деления. Во всех трёх случаях именно скорость деградации, а не скорость синтеза, задаёт время ответа клетки, поэтому кинетические параметры UPS напрямую переводятся в биологический смысл.

Частые ошибки

• Путать моноубиквитинирование с сигналом деградации. Одна молекула убиквитина на субстрате чаще всего означает не «на разбор», а сигнал для эндоцитоза или изменения локализации белка.
• Игнорировать тип связи в цепи. Разрушение через протеасому запускает именно K48-связанная цепь; K63-цепи, например, чаще участвуют в передаче сигнала и репарации ДНК, а не в деградации.
• Забывать про порог длины цепи. Дицепь или трицепь убиквитина может не запустить деградацию вовсе - протеасома нуждается как минимум в тетраубиквитине для эффективного узнавания.
• Не учитывать роль 19S частицы отдельно от 20S. Одна лишь 20S бочка почти не разбирает полноразмерные свёрнутые белки - без 19S частицы нет ни узнавания метки, ни разворачивания субстрата.
• Считать АТФ нужным только для мечения. АТФ расходуется и на активацию убиквитина ферментом E1, и на разворачивание субстрата регуляторной частицей - оба этапа энергозависимы.

FAQ

Сколько молекул убиквитина нужно, чтобы белок разрушила протеасома? Эффективное узнавание требует K48-полиубиквитиновой цепи минимум из четырёх звеньев (тетраубиквитин). Более короткие цепи резко снижают вероятность деградации и чаще служат другим клеточным сигналам.

Почему протеасому называют 26S, если есть отдельная 20S частица? 20S - это только каталитическая бочка с протеолитической активностью. 26S протеасома - это 20S частица плюс одна или две 19S регуляторные частицы, которые узнают метку, разворачивают белок и подают его внутрь. Без 19S частиц комплекс не может эффективно работать с полноразмерными субстратами.

Куда девается убиквитин после того, как белок разрушен? Деубиквитинирующие ферменты (DUB) снимают полиубиквитиновую цепь с субстрата ещё на входе в 19S частицу и разбирают её на отдельные молекулы, которые возвращаются в клеточный пул убиквитина для новых циклов мечения.

Коротко

Убиквитин-протеасомная система метит белки на разрушение через каскад ферментов E1, E2 и E3, наращивая на субстрате K48-полиубиквитиновую цепь. Протеасома эффективно узнаёт только цепи от четырёх звеньев и длиннее, а сама деградация в 26S протеасоме (20S каталитическая частица плюс 19S регуляторные частицы) требует АТФ на двух стадиях - активации убиквитина и разворачивания субстрата. Кинетика распада помеченного белка подчиняется экспоненте с константой скорости, которая зависит от длины цепи, активности E3-лигазы и запаса АТФ, а сам убиквитин после деградации субстрата возвращается в клеточный пул благодаря деубиквитинирующим ферментам.